검체 준비 소개

현미경 검사에는 다양한 형태가 있지만 가장 일반적으로 사용되는 방법은 표본에 빛을 투사하는 “명시야” 현미경 검사법(전자 현미경의 전자 빔 방식과 반대)입니다. 명시야 현미경 검사법을 사용하여 표본을 성공적으로 검사하기 위한 일반 요건은 다음과 같습니다.

• 표본의 세포와 다른 요소를 ""살아 있는"" 상태로 보존합니다(이 과정을 ""고정""이라고 함)
• 표본은 빛이 통과할 수 있도록 불투명이 아닌 투명한 상태여야 합니다.
• 표본은 세포층이 하나만 있는 얇고 평평한 상태여야 합니다.
• 일부 성분을 다른 색으로 염색하여 명확하게 구분할 수 있어야 합니다.

현미경 검사 요건에 따라 표본 준비 옵션은 다음과 같이 제한됩니다.

• 전체조직 표본 고정(whole-mount): 전체 유기체 또는 구조가 현미경 슬라이드 위에 직접 올려 놓을 수 있을 정도로 작거나 얇은 경우에 사용합니다(예: 작은 단세포, 다세포 유기체 또는 얇게 펴서 슬라이드에 직접 올려 놓을 수 있는 세포막).
• "압착" 표본: 성분을 나타내기 위해 슬라이드 위에서 세포를 의도적으로 짓누르거나 으깨는 방법입니다(예: 염색체를 보기 위해 세포를 분해하는 식물 시료).
• 도말 표본: 시료가 유체 속에 떠 있는 세포로 구성되어 있거나(예: 혈액, 정액, 뇌척수액 또는 미생물 배양) 개별 세포를 표면이나 기관 내에서 긁어내거나 붓으로 바르거나 빨아들이는 경우(박탈 세포학). 도말 표본은 여성 자궁 경부암을 스크리닝하는 데 널리 사용되는 "자궁 경부 세포 도말 검사(Pap test)"의 기초입니다.
• 절편: 표본이 어떠한 방식으로든지 지지되어 아주 얇은 슬라이스를 잘라내고 슬라이드 위에 염색하고 봉입할 수 있는 경우입니다. “마이크로톰(microtome)”이라는 장비를 사용하여 절편을 준비합니다.

이러한 옵션 중에서 개별 세포와 세포외 성분 간의 구조적 관계를 유지하는 방법은 전체조직 표본 고정과 절편 밖에 없습니다. 도말 표본과 압착 표본은 개별 세포와 관련 세포 수에 대한 상세 정보를 제공하지만 구조적 관계가 손실됩니다. 절편 준비는 이러한 방법 중에서 기술적으로 가장 복잡한 방법으로, 전문 장비와 상당한 수준의 전문 지식이 필요합니다. 병리학자의 절편 현미경 검사는 암 진단의 초석이 됩니다. 절편 준비 방법론은 동물과 식물 모두에서 유사하지만 다음 설명은 특히 동물(인체) 조직에 대한 설명입니다.

가장 신선한 조직은 대부분 매우 섬세하며 쉽게 왜곡되고 손상되므로 어떠한 방식으로든지 절단 과정에서 지지가 되지 않으면 얇은 절편(슬라이스)을 준비할 수 없습니다. 또한 표본은 일반적으로 절편을 준비하기 전에 보존 또는 ""고정""되어야 합니다. 이러한 지지를 위해 광범위하게 사용되는 두 가지 방법은 다음과 같습니다.

1. 조직을 급속 동결시키고 동결 마이크로톰(cryostat microtome, 동결 쳄버 구조의 마이크로톰)을 사용하여 절편을 절단하는 동안 동결 상태를 유지할 수 있습니다. 이를 “동결 절편”이라고 합니다. 동결 절편을 매우 빠르게 준비할 수 있으므로 수술 절차를 진행하기 위해 수술 중 진단이 필요하거나 세포의 화학적 구성에 대한 모든 유형의 간섭을 방지해야 하는 경우에(예: 조직 화학적 검사) 사용됩니다.

2. 또는 액체 약품을 표본에 투입하면 얇은 절편이 적절한 물리적 성질을 갖는 고체로 변환되어 절단할 수 있습니다. 침윤과 지지에는 에폭시 수지 및 메타크릴 수지와 같은 다양한 약품을 사용할 수 있지만 파라핀 왁스 기반의 조직학용 왁스가 일반 편광 현미경 검사에 가장 많이 사용됩니다. 이 방법을 사용하면 일명 "파라핀 절편"이 생성됩니다. 일반적으로 "회전식" 마이크로톰에 이 절편을 준비합니다. "회전식" 장비는 절단 작업을 담당합니다. 모든 조직학 실험실에서는 일상적으로 거의 모든 표본에서 파라핀 절편을 준비하며 진단에 사용합니다.

다음 단락에서는 파라핀 절편 준비의 주요 단계를 설명합니다. 이 단계는 일반적으로 매일 수백 개의 시료를 취급하는 대규모 전문 조직학 실험실의 레이아웃과 워크플로를 나타냅니다.

다양한 방법으로 조직학 검사용 표본을 채취할 수 있습니다. 매우 큰 표본이나 기관 전체부터 아주 작은 조직 단편까지 표본 범위는 다양합니다. 예를 들어 조직학 실험실에서 일반적으로 사용하는 표본 채취 유형은 다음과 같습니다.

• 절제 표본(외과적 생검(surgical biopsy)) : 수술 시 기관 전체 또는 환부를 제거합니다.
• 절개 생검 표본 : 환부에서 진단 목적으로 조직을 제거합니다.
• 착공 생검(punch biopsy) : 검사를 목적으로 펀치를 사용하여 의심스러운 조직을 소량 제거합니다(일반적으로 피부에서 시행).
• 표층 생검(shave biopsy) : 표면(일반적으로 피부)에서 작은 조직 단편을 "깎아냅니다".
• 소파 생검(curetting) : 자궁 또는 자궁 경관 내벽에서 소량의 조직을 제거합니다.
• 원추 생검(cone biopsy) : 특수 바늘로 피부를 관통하여(경피적으로) 작은 조직 표본을 제거합니다.

일반적으로 채취한 표본을 고정액(방부제)에 넣어 운반하지만 표본이 신선한 상태로 도착하여 즉시 고정해야 하는 경우도 있습니다. 실험실에서 표본을 수령하기 전에 증명서(라벨)와 관련 서류를 주의 깊게 검토하여 모든 상세 정보가 기록되고 "표본 추적"이 시작되었는지 확인합니다. 환자 또는 연구용 표본은 올바른 정보 표기로 부정확성 위험을 최소화해야 합니다.

고정은 현미경 검사용 표본을 준비하는 데 있어 중요한 단계입니다. 고정의 목적은 부패를 방지하고 세포와 조직을 "살아 있는" 상태로 보존하는 것입니다. 즉 효소 활동을 중지시키고 미생물을 죽이며 표본을 경화시키는 동시에 적절한 염색 방법(항원-항체 반응과 관련된 방법 및 DNA와 RNA 보존에 따라 다른 방법 포함)을 적용할 수 있도록 분자 구조를 충분하게 유지합니다. 혈액 공급에서 표본을 분리한 후 고정을 바로 시작할수록 더욱 우수한 결과를 얻을 수 있습니다. 가장 널리 사용되는 고정액은 포름알데히드로, 일반적으로 인산염 완충 용액("프로말린"이라고도 함)의 형태입니다. 이상적인 고정 방법은 표본을 처리하기 전 6~12시간 포르말린에 담가두는 것입니다

육안 검사("컷업(cut-up)"이라고도 함)는 표본을 주의 깊게 검사하고 기술하는 작업으로, 여기에는 모양, 조각 수 및 치수가 포함됩니다. 표본이 클수록 적절한 부위에서 대표성을 갖는 표본을 채취하기 위해 추가로 절개해야 할 수 있습니다. 예를 들어 종양의 절제 가장자리에서 여러 표본을 채취하여 종양을 완전히 제거할 수 있습니다. 표본이 작으면 전체 표본을 처리할 수 있습니다. 처리 대상으로 선택된 조직을 카세트(구멍이 뚫린 작은 용기)에 넣으면 조직 처리기에서 왁스까지 처리됩니다.

파라핀 절편을 준비하기 위해 대규모 배치의 표본을 처리하는 경우 "조직 처리기"라고 하는 자동 장비를 사용합니다. 이 장비를 사용하면 표본에 일련의 다른 용제가 침윤되고 녹은 파라핀 왁스로 마감됩니다. 처음에는 표보이 수성 상태이며 녹은 왁스(소수성이며 물과 섞이지 않음) 안에 놓이게 하려면 먼저 탈수 용제와 세척 용제(일반적으로 에탄올과 자일렌)를 여러 번 교환해야 합니다. 특정 표본 배치에 선택한 "처리 일정"의 기간 및 단계 상세 정보는 표본의 특성과 크기에 따라 다릅니다. 일정은 작은 표본의 경우 1시간 정도로 짧을 수도 있고 큰 표본의 경우 12시간 이상 걸릴 수도 있습니다. 표본이 많은 경우 야간에 처리하는 실험실이 많습니다. 최근에는 워크플로가 개선되고 총 처리 시간이 단축되도록 실험실에서 고속 처리가 가능한 처리기를 사용해야 하는 압박을 많이 받고 있습니다.

처리한 표본을 포매기에 넣으면 표본이 카세트에서 제거되어 왁스가 채워진 몰드에 놓여집니다. 이 단계에서는 표본 방향이 중요합니다. 절편이 절단되는 평면을 결정하며 궁극적으로 이상 부위가 현미경에서 보이는지 여부를 결정할 수 있기 때문입니다. 조직이 처리된 카세트에 표본 상세 정보가 표시됩니다. 이제 왁스를 더 추가하여 몰드 위에 올려진 카세트를 부착합니다. 그러면 표본 "블록"이 차가운 표면 위에서 굳게 되고 완전히 굳으면 몰드가 제거됩니다. 이제 카세트에 왁스를 채웁니다. 블록의 일부가 된 카세트는 마이크로톰에서 표본을 고정하는 안정적인 베이스 역할을 합니다. 이제 표본이 포함된 블록에서 절편을 절단할 수 있습니다.

절편은 매우 정교한 강철 칼날을 사용하는 "마이크로톰"이라는 정밀 장비에서 절단됩니다. 파라핀 절편은 일반적으로 3~5 µm 두께로 절단되므로 절편은 단일 세포층만으로 구성됩니다(적혈구 세포의 지름은 약 7 µm). 포매제로서 파라핀 왁스의 장점 중 하나는 절편이 절단될 때 가장자리가 합쳐져 "리본 모양"의 절편이 생성되어 절편을 보다 손쉽게 다룰 수 있다는 점입니다.

이제 부양 수조 내 온수 표면에서 절편이 평평하게 "부양되면" 절편을 현미경 슬라이드 위에 올려 놓습니다. 절편을 완전히 건조시킨 후에 염색할 수 있습니다.

멜라닌과 같은 몇몇 천연 색소 이외에 세포와 대부분의 표본을 구성하는 다른 요소는 무색입니다. 명시야 현미경 검사법을 사용하여 상세한 구조를 파악하려면 표본을 염색해야 합니다. 필수 구조 정보를 제공하기 위한 시작점으로 사용되는 일반 염색은 헤마톡실린-에오신(H&E) 염색입니다. 이 방법을 사용하면 세포 핵은 파란색으로, 세포질과 많은 세포 외 성분은 분홍 색조로 염색됩니다. 조직 병리학에서는 H&E 검사만으로도 많은 조건을 진단할 수 있습니다. 그러나 완벽하게 차별화된 진단 결과를 제공하기 위해 추가 정보가 필요한 경우가 있습니다. 이 경우 보다 전문적인 염색 기법이 필요합니다. 특정 구조 또는 미생물을 정의하기 위해 염료나 금속 물질을 주입하는 "특수 염색"이나 표지 처리된 항체를 사용하고 진단에 유용한 단백질의 위치와 관련 있는 면역-조직 화학 기법(
ISH
))이 이 예입니다. 특정 DNA 또는 RNA 염기 서열을 밝히기 위해 in-situ 부합화(
ISH
))와 같은 분자 생물학적 방법이 필요할 수도 있습니다. 이러한 방법 모두 파라핀 절편에 적용할 수 있으며 대부분의 경우 생성된 슬라이드는 매우 안정적이고 수년 간 보존될 수 있습니다

염색한 절편은 유리 커버슬립으로 덮여져 병리학자에게 전달되며 병리학자는 현미경으로 관찰하여 적절한 진단과 함께 보고서를 준비합니다.