열 유도 에피토프 복구의 기술 개요

IHC 의 가치 또는 능력은 종종 조직 고정과 처리에 의해 훼손됩니다. 포르말린 기반 고정액은 형태, 세포학, 조직 구조의 뛰어난 보존을 제공하지만, IHC 기법의 민감도를 크게 감소시킵니다. 포름알데히드는 조직 단백질에 공유 결합하며, 또한 인접 단백질 또는 펩타이드와 교차결합하여 커다란 단백질 응집체를 형성하는 역할을 수행합니다. 단백질과 펩타이드의 항원에 대한 교차결합은 에피토프를 차단 또는 “은폐”하기에 항체 결합을 방해하는 것으로 생각됩니다.

열 유도 에피토프 복구(HIER)는 간단히 말해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직에서 항원 반응성을 회복하기 위해 특정 완충액과 함께 열을 사용하는 것으로 정의될 수 있습니다. HIER 절차는 진단 과정에서 IHC 를 이용하는 방식에 큰 영향을 미쳤습니다. 포르말린 고정 조직에서 일상적으로 분석하는 많은 IHC 표지자들은 15~20년 전에는 이러한 방식으로 평가할 수 없었습니다.

HIER이 작용하는 기전은 명확하지 않을지라도, 대부분은 이 절차가 일정 방식으로 항원의 포름알데히드 매개 화학 변형을 역전시킨다는 데 동의합니다. 이러한 역전이 발생할 수 있는 방식에 관한 많은 이론들이 있습니다. 이들 중 가장 중요한 이론은 HIER 공정의 열 에너지가 주변 단백질 또는 펩타이드를 항원에 결합시키는 교차결합을 파괴한다는 것입니다. 이 시나리오에서, HIER은 에피토프를 “드러내거나” 또는 공개하는 기능을 수행합니다. 다른 이론에서, HIER은 교차결합 부위로부터 결합된 칼슘 이온을 제거함으로써 작용하는 것으로 생각됩니다. 이 이론은 구연산, EDTA와 같은 여러 HIER 완충액이 칼슘 킬레이트제로 기능한다는 사실에 의해 뒷받침됩니다.

마이크로파, 야채 찜기, 압력솥, 수조를 포함한 다양한 열원이 모두 HIER에 성공적으로 사용되었습니다. 열원의 온도는 HIER 공정에 중요한 요인입니다. 일반적으로, HIER 용액의 온도가 높을수록 에피토프 회수에 보다 효과적입니다.

찜기, 수조, 마이크로파는 94~100°C 범위의 온도를 생성합니다. 압력솥은 110~120°C의 온도를 발생시킬 수 있습니다. 이 열원이 달성한 온도 차이는 가열 시간을 조정하여 보정할 수 있습니다. 온도가 낮을 경우, 보다 높은 온도에서 관찰된 염색 강도와 동등하게 생성하기 위해 보다 긴 노출 시간이 필요합니다. 따라서 최대 온도 차이를 보정하기 위한 가열 시간을 적절하게 조정하여 전술한 열원들 중 하나를 사용하여 유사한 염색 강도를 생성할 수 있습니다.

각 열원이 HIER에 적합할지라도, 각 열원과 관련된 장단점이 있습니다(표 1). 처음 널리 사용된 HIER 열원인 마이크로파는 아마도 오늘날 가장 적게 사용되는 열원일 것입니다. 마이크로파 내에서 열 분포는 종종 균일하지 않거나 일관되지 않습니다. 균일하지 않은 가열은 염색 강도의 재현성 결여를 초래합니다. 마이크로파 사용의 추가 단점은 이 열원에서 자주 발생하는 강한 비등입니다. 비등 HIER 용액의 교반 작용으로 인해 슬라이드에서 조직이 분리될 수 있습니다.

마이크로파와 반대로, 압력솥, 찜기, 수조는 균일하고 일관된 열 분포를 생성합니다. 압력솥이 생성하는 보다 높은 온도는 짧은 시간에 에피토프 반응성의 효과적인 회복을 달성할 수 있다는 점에서 유리할지라도, 보다 높은 온도는 형태를 손상시키거나 왜곡시킬 수 있습니다. 압력솥을 사용할 때 결합 조직이 잘게 조각나거나 탄 것처럼 보일 수 있습니다.

HIER 개발 이후, 광범위한 완충액이 사용되었습니다. 현재, HIER 용액은 pH와 완충액 조성에 기반하여 3개의 범주로 분류할 수 있습니다.

1. 글리신-HCI로 완충하는 낮은 pH(pH 약 3~5) 용액
2. 구연산으로 완충하는 낮거나 중성 pH(pH 약 6~7) 용액
3. Tris 또는 EDTA로 완충하는 높은 pH(pH 약 8~10)

현재 증거는 HIER 용액의 pH가 완충액 조성보다 중요함을 시사합니다. 대부분의 에피토프의 최적의 회수는 pH가 8~10 범위인 알칼리성 완충액에서 발생합니다. EDTA 완충액은 과다 고정 표본, 검출하기 어려운 항원 회수에 특히나 효과적입니다. 높은 pH와 EDTA 기반 완충액도 단점이 있습니다. 용액의 pH가 높을수록 현미경 슬라이드에서 절편이 손실될 가능성이 더 높습니다. 또한 EDTA 용액은 왜곡된 형태, 구불구불한 기이한 형태의 핵을 초래할 수 있습니다. 지금 현재, 모든 항원에 최적인 “범용” HIER 완충액은 없습니다. 각 실험실은 흔히 평가하는 다양한 항원 회수에 대한 다른 HIER 용액의 효과를 평가해야 합니다. 일반적인 접근법은 대부분의 항원에 구연산과 같은 완충액을 사용하는 것입니다. 높은 pH 또는 EDTA 기반 용액은 구연산으로 복구하기 어려울 수 있는 항원용으로 적용할 수 있습니다.

HIER 기법은 기사 또는 병리학자에게 열원과 완충액에 관한 놀라운 선택의 폭을 제공합니다.
이러한 선택 또는 질문은 공정에 사용되는 장비와 기본 시약의 장단점을 이해함으로써 단순화할 수 있습니다.

이 선택은 검사실에서 정한 성능 기준 또는 기대치의 맥락에서 이루어져야 합니다. 기사와 병리학자는 최소한 다른 열원 또는 회수 완충액이 재현성, 민감도, 특이성에 미치는 잠재적 영향을 이해해야 합니다.
또한 열원과 완충액의 잠재적인 유해 효과도 고려해야 합니다.