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改善原位杂交 (ISH) 的步骤

Geoffrey Rolls
Geoffrey Rolls BAppSc, FAIMS

为制备组织学检查标本，从患者到病理学家都需要谨慎、熟练和并对规范烂熟于心。 本指南为达到最佳实践技巧提供了可操作性的建议和避免出现常见错误的简便方法。

本周指南中强调了改善原位杂交 (ISH) 的技巧。 我们希望能够为每个步骤提供宝贵的组织学规范提醒，并且在发生不符合要求的结果时能够帮助排除问题。

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步骤 89 - 使用高质量切片

 

特别注意应使用已彻底干燥的平整切片来制备玻片。 使用带电荷载玻片进行 ISH。
 

不均匀、粘合不良的切片，染色不均匀，背景染色杂乱。
该劣质切片显示切片翘起和背景染色 (HPV)。
该劣质切片显示切片翘起和背景染色 (HPV)。

步骤 90 - 原位杂交确保最佳固定

 

使用已知且一致的固定条件（固定液类型、pH 值、温度、时间）进行高质量固定可产生最佳结果。
 

固定条件不一致，组织固定不足或过度固定，则会获得不一致的结果，并且问题排除起来非常困难。
A 固定良好的扁桃体组织 κ 轻链 mRNA ISH 显示出明显的强阳性反应。 B 固定不佳的扁桃体组织 κ 轻链 mRNA ISH 显示出弱阳性反应。
A 固定良好的扁桃体组织 κ 轻链 mRNA ISH 显示出明显的强阳性反应。 B 固定不佳的扁桃体组织 κ 轻链 mRNA ISH 显示出弱阳性反应。

步骤 91 - 避免粘合问题

 

避免在浮选槽中使用含蛋白质的切片粘合剂（胶水、淀粉或明胶），尤其是带电荷载玻片上。
 

含蛋白质的粘合剂会遮盖带电荷载玻片的表面。 这会导致不均匀粘合，并且由于 ISH 试剂汇集在翘起切片下方而导致不均匀染色。
切片旁可见含蛋白质的切片粘合剂厚层染色（乳腺，PR）。
切片旁可见含蛋白质的切片粘合剂厚层染色（乳腺，PR）。

步骤 92 - 优化除蜡和试剂应用

 

特别注意切片脱蜡和水化，以及试剂在标本表面的有效和均匀分布。 这可确保均匀一致的染色结果。
 

除蜡不完全可导致切片中出现未染色或染色不良的区域。 预处理或染色期间切片表面上的气泡可能导致问题。
在 95°C 预处理期间形成的气泡导致染色不均 (HPV)。
在 95°C 预处理期间形成的气泡导致染色不均 (HPV)。

步骤 93 - 仔细选择探针

 

根据敏感性和特异性仔细选择探针。
 

“我们购买探针时只看价格。”
使用不同来源的寡核苷酸探针，通过 ISH (BCIP/NBT) 对两张扁桃体切片进行 κ 轻链 mRNA 染色。 切片 A 显示强染色，而切片 B 显示弱染色，且染色细胞较少。
使用不同来源的寡核苷酸探针，通过 ISH (BCIP/NBT) 对两张扁桃体切片进行 κ 轻链 mRNA 染色。 切片 A 显示强染色，而切片 B 显示弱染色，且染色细胞较少。

步骤 94 - 阅读说明书

 

了解您的探针。 确保阅读过说明书，以确定您的方法对于特定探针的适用性。 仔细控制温度和时间，以提供最佳杂交条件。 这些参数必须完全正确，以确保发生特异性最高的结合反应。
 

无需查看实验室的探针数据表： “我们只需遵循标准方法”。
使用相同的 DNA 探针在不同的杂交条件下，通过 ISH 对两张湿疣切片进行 HPV 染色。 切片 A 呈强染色，而切片 B 染色不符合要求。
使用相同的 DNA 探针在不同的杂交条件下，通过 ISH 对两张湿疣切片进行 HPV 染色。 切片 A 呈强染色，而切片 B 染色不符合要求。

步骤 95 - 优化预处理条件

 

选择适当的预处理和优化条件。 这取决于固定和组织类型。
 

对不同探针使用相同的酶预处理条件有时可能导致结果不佳。
该结肠切片已使用 Poly d(T) 阳性对照探针染色。 该切片显示了蛋白酶 K 过度消化的结果。可见黏膜上皮细胞质结构丧失和重度背景染色。
该结肠切片已使用 Poly d(T) 阳性对照探针染色。 该切片显示了蛋白酶 K 过度消化的结果。可见黏膜上皮细胞质结构丧失和重度背景染色。

步骤 96 - 小心处理组织

 

小心处理组织标本并及时固定，可以减少内源性 RNA 酶引起的 RNA 丢失。
 

不当处理组织标本和延迟固定将增加内源性 RNA 酶引起的 RNA的丢失。
RNA 酶分解核 RNA 导致的弱染色。 使用 Poly d(T) 阳性对照探针染色的扁桃体。
RNA 酶分解核 RNA 导致的弱染色。 使用 Poly d(T) 阳性对照探针染色的扁桃体。

步骤 97 - 使用适当的检测系统

 

选择灵敏的检测和可视化系统，并优化孵育条件。
 

如果检测和可视化系统缺乏灵敏度，即使探针与靶点结合，也可能导致极弱甚至阴性染色。
该扁桃体切片的弱染色是由于检测系统缺乏灵敏度。 使用非聚合物检测试剂盒对 λ 轻链进行 ISH。
该扁桃体切片的弱染色是由于检测系统缺乏灵敏度。 使用非聚合物检测试剂盒对 λ 轻链进行 ISH。

步骤 98 - 避免试剂蒸发

 

在孵育期间防止探针溶液和其他试剂蒸发。 由于需要长时间孵育，试剂干燥是一个常见问题。 使用优质设备至关重要。
 

如果探针或其他试剂在切片上干燥（通常在边缘），则可能导致这些区域出现非特异性染色。
在杂交后甲酰胺洗涤过程中，用于进行 κ 轻链 ISH 染色的该扁桃体切片干燥，导致不均匀的非特异性染色。
在杂交后甲酰胺洗涤过程中，用于进行 κ 轻链 ISH 染色的该扁桃体切片干燥，导致不均匀的非特异性染色。

步骤 99 - 标准化清洗步骤

 

在整个过程中使用标准化清洗步骤（持续时间、体积和搅拌形式）。 这将确保结果的一致性。
 

使用相同探针进行的同一批检测中以及不同日期的检测批次之间结果存在高度变异性。 这可能是因为不同操作员使用了不同清洗技术。
这些 κ 轻链 ISH 染色的扁桃体切片显示了清洗如何影响最终结果。 切片 A 显示由于清洗技术不佳而导致过度背景染色，而切片 B 经过正确清洗，没有背景染色。
这些 κ 轻链 ISH 染色的扁桃体切片显示了清洗如何影响最终结果。 切片 A 显示由于清洗技术不佳而导致过度背景染色，而切片 B 经过正确清洗，没有背景染色。

步骤 100 - 使用适当的对照

 

每次检测时均使用适当的对照。 这应包括已知的阳性组织和使用非特异性探针的阴性对照。
 

“只有当我们的方法似乎不起作用时，我们才使用对照。 如果每次检测都使用对照，则没有人会对它进行观察。”
使用 Poly d(T) 阳性对照探针染色的扁桃体切片。 精确染色表明组织固定良好，RNA 序列保持良好。
使用 Poly d(T) 阳性对照探针染色的扁桃体切片。 精确染色表明组织固定良好，RNA 序列保持良好。

步骤 101 - 认真评估结果

 

在染色后评估检测切片以及对照时，应知道要观察的内容及其位置。 进行 ISH 的任何人都应掌握有关该技术的基础理论以及如何观察阳性染色的基本知识。
 

如果在检测切片中观察到任何染色，则认为染色符合要求。
已经对阴性对照扁桃体切片进行 ISH 的所有步骤，但没有应用探针。 图中可见含铁血黄素，显示为天然棕色，另外其与二氨基联苯胺 (DAB)结合可使颜色加强。 这不代表阳性染色。
已经对阴性对照扁桃体切片进行 ISH 的所有步骤，但没有应用探针。 图中可见含铁血黄素，显示为天然棕色，另外其与二氨基联苯胺 (DAB)结合可使颜色加强。 这不代表阳性染色。

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About the presenter

Geoffrey Rolls
Geoffrey Rolls , BAppSc, FAIMS

Geoffrey Rolls is a Histology Consultant with decades of experience in the field. He is a former Senior Lecturer in histopathology in the Department of Laboratory Medicine, RMIT University in Melbourne, Australia.

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